Microscopie à fluorescence: principes de la méthode

Absorption et réémission de la lumièreLes milieux inorganiques et organiques sont le résultat de la phosphorescence ou de la fluorescence. La différence entre les phénomènes consiste en la durée de l'intervalle entre l'absorption de la lumière et l'émission du flux. Avec la fluorescence, ces processus se produisent presque simultanément, et avec phosphorescence - avec un certain retard.

Contexte historique

En 1852 le scientifique britannique Stokes a d'abord décrit la fluorescence. Il a introduit un nouveau terme à la suite d'expériences réalisées avec du spath fluor, qui émettait de la lumière rouge sous l'influence des ultraviolets. Stokes a noté un phénomène intéressant. Il a constaté que la longueur d'onde avec un rayonnement fluorescent est toujours supérieure à celle du flux lumineux d'excitation.

Pour confirmer l'hypothèse au 19ème siècle, il y avaitbeaucoup d'expériences ont été réalisées. Ils ont montré qu'une variété d'échantillons fluorescent sous l'action de l'ultraviolet. Parmi les matériaux, entre autres, étaient des cristaux, des résines, des minéraux, de la chlorophylle, des matières premières médicinales, des composés inorganiques, des vitamines, des huiles. L'application directe des colorants pour effectuer des analyses biologiques n'a commencé qu'en 1930.

Microscopie à fluorescence: description

Certains des matériaux utilisés dans les études de la première moitié du XXe siècle ont une grande spécificité. Merci à des indicateurs qui ne pouvaient pas être obtenus par des méthodes de contraste, méthode de microscopie de fluorescence est devenu un outil important dans la recherche biomédicale et biologique. Les résultats obtenus n'étaient pas négligeables pour la science des matériaux.

Quels sont les avantages de la microscopie à fluorescence?? Avec l'aide de nouveaux matériaux, il est devenu possibleisolement de cellules hautement spécifiques et de composants submicroscopiques. Un microscope à fluorescence peut détecter des molécules individuelles. Une variété de colorants permettent l'identification de plusieurs éléments en même temps. Malgré la résolution spatiale limitée de l'équipement par la limite de diffraction, qui dépend elle-même des propriétés spécifiques de l'échantillon, la détection de molécules en dessous de ce niveau est également tout à fait possible. Différents échantillons après irradiation présentent une autofluorescence. Ce phénomène est largement utilisé en pétrologie, en botanique, dans l'industrie des semi-conducteurs.

Caractéristiques

Étude de tissus animaux ou pathogènesLes micro-organismes sont souvent compliqués par une auto-fluorescence non spécifique, trop faible ou très forte. Cependant, la signification dans les études est l'introduction dans le matériau de composants excités à une longueur d'onde particulière et émettant un flux lumineux de l'intensité requise. Les fluorochromes agissent comme des colorants capables de s'attacher aux structures (invisibles ou visibles). En même temps, ils sont très sélectifs en ce qui concerne les cibles et le rendement quantique.

Microscopie à fluorescence est devenu largement utilisé avec l'avènement decolorants naturels et synthétiques. Ils possédaient certains profils d'intensité de l'émission et l'excitation et ciblées sur des cibles biologiques spécifiques.

Identification de molécules individuelles

Souvent dans des conditions idéales, vous pouvez vous inscrirelueur d'un élément séparé. Pour ce faire, entre autres choses, il est nécessaire d'assurer un bruit de détecteur suffisamment faible et un arrière-plan optique. La molécule de fluorescéine avant la destruction due au photoblanchiment peut émettre jusqu'à 300 000 photons. À 20% de la collection et l'efficacité du processus, ils peuvent être enregistrés dans la quantité d'environ 60 mille.

Microscopie à fluorescence, basé sur des photodiodes à avalanche ou la multiplication d'électrons, a permis aux chercheurs d'observer le comportement de molécules individuelles pendant quelques secondes, et dans certains cas, minutes.

Difficultés

Le problème clé est la suppression du bruitfond optique. En raison du fait que de nombreux matériaux utilisés dans la conception des filtres et des lentilles présentent une certaine autofluorescence, les efforts des scientifiques au stade initial se sont concentrés sur la production de composants qui possèdent une faible fluorescence. Cependant, des expériences ultérieures ont conduit à de nouvelles conclusions. En particulier, il a été constaté que microscopie à fluorescence, basé sur la réflexion interne totale, permet d'obtenir un fond faible et un flux lumineux excitant à haute intensité.

Mécanisme

Principes de la microscopie à fluorescence, basé sur la réflexion interne totale,sont l'utilisation d'une onde rapidement amortie ou non propagative. Il se pose sur la frontière de médias avec différents indices de réfraction. Dans ce cas, le faisceau lumineux traverse le prisme. Il a un indice de réfraction élevé.

Le prisme jouxte une solution aqueuse ou un verre avecparamètre bas. Si le flux de lumière y est dirigé selon un angle supérieur à celui critique, le faisceau est complètement réfléchi par l'interface. Ce phénomène, à son tour, provoque une onde qui ne se propage pas. En d'autres termes, un champ électromagnétique est généré qui pénètre dans le milieu avec un indice de réfraction plus faible sur une distance inférieure à 200 nanomètres.

Dans une onde non propagative, l'intensité de la lumièresera tout à fait suffisant pour exciter les fluorophores. Cependant, en raison de sa profondeur extrêmement faible, son volume sera très faible. Par conséquent, un arrière-plan de bas niveau apparaît.

Modification

La microscopie à fluorescence sur la base complèteréflexion interne, peut être réalisée à l'aide de l'épi-illumination. Cela nécessite des lentilles avec une ouverture numérique accrue (au moins 1,4, mais il est souhaitable qu'elle atteigne 1,45-1,6), ainsi qu'un champ partiellement éclairé de l'appareil. Ce dernier est réalisé en utilisant une tache de petite taille. Pour une plus grande uniformité, un anneau mince est utilisé, à travers lequel une partie de l'écoulement est bloquée. Pour obtenir un angle critique, après lequel une réflexion totale se produit, un niveau élevé de réfraction du milieu d'immersion dans les lentilles et le verre de couverture du microscope est nécessaire.

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